SMR

Actualités du syndrome d’hyperstimulation ovarienne J.M. Antoine

A la recherche de facteurs prédictifs de la spermatogenèse dans l’azoospermie sécrétoire. Patrick Fenichel

La transplantation des cellules germinales dans le testicule : une nouvelle perspective de l’AMP ?

Jean-Pierre DADOUNE
Service d’Histologie, Biologie de la Reproduction et Cytogénétique
Hôpital Tenon, 4 rue de la Chine, 75020 Paris

Depuis la naissance du premier enfant engendré par fécondation in vitro en 1978, l’Assistance Médicale à la Procréation, promue au rang de Biologie Interventionnelle, n’a cessé de reculer les limites du possible, à seule fin de pallier à l’infertilité féminine d’abord et masculine ensuite. L’avènement de la micro-injection du spermatozoïde dans l’ovocyte (“ Intracytoplasmic Sperm Injection ” – ICSI -) a modifié radicalement la prise en charge de la stérilité masculine. Réalisée à partir d’un nombre réduit de spermatozoïdes prélevés initialement dans l’éjaculat, puis dans l’épididyme et enfin dans le testicule, cette technique a offert la possibilité de paternité à des hommes considérés jusqu’alors comme stériles. Féconder l’ovocyte sans l’intervention du spermatozoïde est devenu une réalité quand, dans le droit fil des données inédites acquises chez la souris, certains ont préconisé la micro-injection dans l’ovocyte de spermatides allongées matures (1), de jeunes spermatides rondes (2), ou même très récemment de spermatocytes II, précurseurs haploides immédiats des spermatides (3). Cependant, le recours aux spermatides rondes et aux spermatocytes II est loin de faire l’unanimité et les résultats obtenus sont plutôt décevants : à ce jour, seulement trois naissances d’enfants viables ont été rapportées après fécondation de l’ovocyte par spermatide ronde (4) et une grossesse a été obtenue après injection intra-ovocytaire de spermatocyte II (3). Mais déjà, la tentation d’utiliser des cellules germinales diploïdes pourrait se manifester. Une étude très récente a, en effet, démontré que les spermatocytes primaires de souris sont capables d’effectuer les deux divisions méiotiques à l’intérieur de l’ovocyte (5). En fait, cette technique est plus compliquée qu’il n’y paraît. Après injection du noyau d’un spermatocyte primaire dans un ovocyte mature, le premier globule polaire issu de la première division du spermatocyte est transféré dans un second ovocyte mature où il poursuit la deuxième division. D’autre part, le développement embryonnaire et néonatal des souriceaux est loin d’être totalement assuré. Néanmoins, les cellules germinales diploïdes deviennent à leur tour des candidats potentiels à la fécondation.

Dans cette logique de l’évolution à rebours de la lignée germinale, peut-on imaginer de recourir à des cellules encore moins différenciées, telles que les spermatogonies ? Des travaux réalisés durant ces cinq dernières années, avec un abord expérimental complètement différent, ont rendu cette hypothèse crédible. En l’occurrence, il ne s’agit pas d’utiliser des spermatogonies à des fins de micro-injection intra-ovocytaire, mais de leur fournir les conditions nécessaires à la poursuite de la spermatogenèse, grâce à leur implantation dans un testicule receveur. C’est à BRINSTER et ZIMMERMANN que revient le mérite d’avoir effectué, en 1994 (6), les premières transplantations de cellules germinales dans le testicule. Utilisant des souris transgéniques, ces auteurs ont montré que les cellules germinales du donneur, porteuses d’un transgène lac-Z permettant leur identification sont capables d’induire la spermatogenèse quand elles sont transférées dans les testicules de mutants de souris génétiquement stériles, ou rendues stériles par traitement au busulfan. Des résultats complémentaires ont montré que la transmission à la descendance de l’haplotype des animaux donneurs est assurée par la lignée germinale (7). Depuis, d’autres avancées méthodologiques déterminantes, dues également au groupe animé par BRINSTER, ont élargi le champ d’application de la transplantation, en lui conférant une plus grande souplesse d’utilisation. Ainsi, des suspensions de cellules germinales en provenance de testicules de souris jeunes ou adultes ont pu être cryoconservées pendant plusieurs mois avant la transplantation et les cellules souches du donneur ont généré une spermatogenèse normale dans le testicule receveur (8). Dans le même temps, la transplantation des cellules germinales dans le testicule d’une autre espèce (transplantation xénogénique) a été réalisée avec succès. Le transfert de cellules germinales de rats fertiles dans le testicule de souris immuno-déficientes a abouti à une spermatogenèse en tout point conforme à celle du rat (9). Il a été établi ensuite que l’évolution spatio-temporelle de la spermatogenèse du rat n’est nullement affectée par la présence des cellules de Sertoli de souris, signifiant par la-même que le processus de différenciation de la lignée germinale est régulé par les cellules germinales elles-mêmes (10). Il y a quelques mois ont été publiés des résultats très prometteurs indiquant que les spermatogonies de souris peuvent être maintenues en culture pendant quatre mois environ et qu’elles sont capables de générer la spermatogenèse après transplantation dans les tubes séminifères d’un receveur approprié (11). Avec ce dernier volet, on peut concevoir toute une série de variantes de la transplantation de cellules germinales : dans le testicule (orthotopique), voire dans un autre organe (hétérotopique), chez le même individu (autologue), chez un autre individu de la même espèce (hétérologue), ou d’une espèce différente (xénogénique) (figure 1). Par ailleurs, la culture des cellules souches ouvre la voie à la production de cellules transfectées, susceptibles d’être transplantées dans un testicule hôte, pour générer des spermatozoïdes transfectés. Ces spermatozoïdes pourraient alors être utilisés pour féconder l’ovocyte et conduire à la naissance d’une progéniture transgénique hybride (12).

Il a été beaucoup question de souris jusqu’ici. Qu’en est-il pour l’homme ? Jusqu’à ce jour et, depuis peu, seule la technique de transfert des cellules germinales dans le testicule semble maîtrisée. En effet, l’injection échoguidée de cellules germinales dans le rete testis a été testée avec succès sur des testicules isolés en provenance de quatre espèces différentes dont l’homme, et l’efficacité de ce mode d’introduction des cellules germinales a été confirmée in vivo chez le singe (13). La sauvegarde des testicules chez des patients atteints de cancer serait l’indication la plus immédiate de la transplantation autologue de cellules souches testiculaires. Le prélèvement des cellules germinales avant le traitement, leur cryoconservation et la retransplantation ultérieure après guérison serait un moyen rapide et efficace de restaurer la spermatogenèse. Parmi les applications de la transplantation de cellules germinales chez l’homme, celle-ci serait assurément la moins contestable sur le plan de l’éthique.

Ainsi, la transplantation des cellules germinales dans le testicule commence à sortir de la phase expérimentale. Sans nul doute, son application au traitement de l’infertilité masculine est appelée à se développer. Toutefois, il faut savoir que, d’ores et déjà, se dessine une nouvelle perspective thérapeutique. En effet, dans le prolongement des nombreuses tentatives effectuées chez les mammifères pour maintenir en culture les cellules germinales jusqu’au stade terminal de la différenciation, les résultats obtenus dernièrement par Jan TESARIK et collaborateurs donnent à penser que la spermatogenèse humaine “in vitro” est maintenant réalisable. Selon cette équipe, les cellules préméiotiques en provenance de biopsies de testicule normal (14) ou pathologique (15) sont en état de poursuivre leur différenciation transméiotique et postméiotique, quand elles sont mises en culture en présence de FSH recombinante.

Références

(1) Fishel S., Green S., Bishop M., Thornton S., Hunter A., Fleming G. and Al Hassan S. Pregnancy after intracytoplasmic injection of spermatid. The Lancet, 1995, 345, 1641-1642.

(2) Tesarik J., Mendoza C. and Testart J. Viable embryos from injection of round spermatids into oocytes. N. Engl. J. Med., 1995, 333, 525.

(3) Sofikitis N., Mantzavinos T., Loutradis D., Yamamoto Y., Tarlatzis V. and Miyagawa I. Ooplasmic injections of secondary spermatocytes for non-obstructive azoospermia. The Lancet, 1998, 351, 1177-1178.

(4) Vanderzwalmen P., Nijs M., Stecher A., Zech H., Bertin G., Lejeune B., Vandamme B. and Chatziparasidou A. Is there a future for spermatid injections ? Human. Reprod., 1998, 13, suppl. 4, 71-84.

(5) Sasagawa I., Kuretake S., Eppig J.J. and Yanagimachi R.. Mouse primary spermatocytes can complete two meiotic divisions within the oocyte cytoplasm. Biol. Reprod., 1998, 58, 248-254.

(6) Brinster R.L. and Zimmermann J.W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11298-11302.

(7) Brinster R.L. and Avarbock M.R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11303-11307.

(8) Avarbock M.R., Brinster C.J. and Brinster R.L. Reconstitution of spermatogenesis from frozen spermatogonial stem cells. Nat. Med., 1996, 2, 693-696.

(9) Clouthier D.E., Avarbock M.R., Maika S.D., Hammer R.E. and Brinster R.L. Rat spermatogenesis in mouse testis. Nature, 1996, 381, 418-421.

(10) França L.R., Ogawa T., Avarbock M.R., Brinster R.L. and Russell L.D. Germ cell genotype controls cell cycle during spermatogenesis in the rat. Biol. Reprod., 1998, 59, 1371-1377.

(11) Nagano M., Avarbock M.R., Leonida E.B., Brinster C.J. and Brinster R.L. Culture of mouse spermatogonial stem cells. Tissue and Cell, 1998, 30, 389-397.

(12) Schlatt S. Prospects and problems for germ cell transplantation in the male. Int. J. Androl., 1999, 22, 13-18.

(13) Schlatt S., Rosiepen G., Weinbauer G.F., Rolf C., Brook P.F. and Nieschlag E. Germ cell transfer into rat, bovine, monkey and human testes. Human. Reprod., 1999, 1, 144-150.

(14) Tesarik J., Greco E., Rienzi L., Ubaldi F., Guidi M., Cohen-Bacrie P. and Mendoza C. Differentiation of spermatogenic cells during in-vitro culture of testicular biopsy samples from patients with obstructive azoospermia : effect of recombinant follicle stimulating hormone. Human Reprod., 1998, 13, 2772-2781.

(15) Tesarik J., Bahceci M., Ozcan C., Greco E. and Mendoza C. Restoration of fertility by in-vitro spermatogenesis. The Lancet, 1999, 353, 555-556.

Légende figure 1

Modalités prospectives de la transplantation de cellules germinales dans le testicule (d’après (12)).

Les prélèvements de spermatozoïdes en vue d’ICSI

J.M. RIGOT
Service d’Urologie – Hôpital Claude Huriez – 59037 LILLE CEDEX

L’anastomose épididymodéférentielle et la vaso-vasostomie ont été longtemps les seules approches possibles de l’azoospermie excrétoire. C’est en 1984 que PRYOR et TEMPLE SMITH devaient proposer l’utilisation du sperme prélevé chirurgicalement associée à une fécondation in vitro. Les résultats étaient décevants et c’est l’apport de l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes qui devait améliorer significativement les résultats et donner un nouvel élan à cette approche (1). Définir une stratégie impose d’être capable d’évaluer la présence ou non de spermatozoïdes avant le geste opératoire, en fonction de l’étiologie présumée de décider une technique particulière voire même d’une possibilité de réparation de la voie séminale, de proposer éventuellement une autoconservation de sperme prélevé chirurgicalement, enfin et surtout de voir avec le couple si celui-ci souhaite une approche dite synchrone c’est à dire de prélèvement chirurgical réalisé dans le même temps que la ponction ovocytaire ou asynchrone c’est à dire le prélèvement chirurgical réalisé de façon dissociée de l’éventuel prélèvement ovocytaire. C’est la confrontation de ces différents aspects avec le couple mais aussi au sein de l’équipe qui doit amener la prise en charge la plus adaptée.

La première question devant le couple est de prédire ou non l’existence de spermatozoïdes lors d’un éventuel prélèvement chirurgical. Si l’extraction est en règle possible quel que soit le lieu de prélèvement (déférent, épididyme, testicule) lorsque l’azoospermie est d’origine excrétoire, il n’en est pas de même dans les cas d’azoospermie sécrétoire. Il convient d’ailleurs de différencier deux types d’azoospermie sécrétoire : celles qui le sont a priori avant le geste opératoire (antécédents évocateurs, hypotrophie testiculaire bilatérale, FSH élevée, marqueurs séminaux normaux) et celles définies au vu du résultat histologique de contrôle c’est-à-dire donc un classement a posteriori. Pour simplifier au vu des nombreuses études actuelles, on peut dire qu’en pré-opératoire, si la FSH est normale, il y a plus de 9/10 chances de retrouver des spermatozoïdes. En revanche, en cas d’élévation de la FSH, (2,3,4,5), les chances de retrouver des spermatozoïdes ne sont que de 50 % voire moins.

Les techniques de prélèvement ont leur importance. A l’heure actuelle, le débat oppose des techniques percutanées moins invasives aux techniques chirurgicales classiques. Dans les azoospermies excrétoires, il semble qu’on puisse considérer que les prélèvements percutanés et chirurgicaux sont équivalents en terme de possibilité d’extraction de spermatozoïdes, peut-être pas pour ce qui est de la quantité de spermatozoïdes prélevée. Il n’en est pas de même dans les azoospermies sécrétoires où la biopsie testiculaire chirurgicale reste le gold standard. Le débat n’est pas tranché entre la réalisation de multiples biopsies ou d’une simple biopsie mais de taille plus importante. Bien entendu, chaque fois que possible une réparation de la voie séminale devra être tentée dans le même temps (6,7,8,9).

L’autre volet, indissociable de la technique opératoire, est la possibilité ou non de réaliser une congélation du sperme extrait afin de limiter les prélèvements itératifs. Dans les azoospermies excrétoires, il semble ne pas y avoir de différence entre le sperme congelé et le sperme frais. Dans les azoospermies sécrétoires, le débat reste ouvert, même si certains articles tendent à laisser penser que là non plus il n’y a pas de différence. On notera dans ces articles que le classement des azoospermies sécrétoires est toujours fait a posteriori et que, en fonction des éléments à notre disposition, les résultats sont très différents.

L’information des couples doit être complète, chaque cas discuté en réunion multidisciplinaire. Il s’agira en effet de décider alors si on s’oriente vers un prélèvement synchrone c’est-à-dire prélèvement chirurgical de spermatozoïdes et prélèvement ovocytaire le même jour ou vers un prélèvement asynchrone c’est-à-dire un prélèvement chirurgical dissocié dans le temps du prélèvement ovocytaire (soit sur un autre cycle soit sur un cycle de stimulation ovocytaire mais dans les jours précédents pour permettre une éventuelle culture de spermatozoïdes) :

Les éléments à notre disposition aujourd’hui permettent de dire que dans les azoospermies excrétoires, il n’y a pas de différence en terme de grossesse/couple entre sperme frais ou congelé en dehors du fait qu’une première tentative réalisée avec du sperme frais permet d’avoir une évaluation de la fécondance du sperme de référence. Dans le cas particulier des patients vasectomisés, il semble que l’attitude de référence, sauf cas particuliers, doivent être la tentative de reperméation associée à l’autoconservation de sperme prélevé chirurgicalement (10).

Il n’en est pas de même dans les azoospermies sécrétoires. Deux écoles continuent de s’opposer : les adeptes de la biopsie exploratoire avec éventuellement autoconservation afin d’éviter un recueil négatif pour la partenaire. Cette attitude est certainement la meilleure si on tient comme préalable le fait que le sperme congelé est équivalent dans cette indication de sperme frais, cela est plus discutable si tel n’est pas le cas et surtout dans les cas très limites où un éventuel recueil ne permettant pas une congélation impose un deuxième prélèvement chirurgical à plus de six mois de distance, éventuellement sur des testicules très hypotrophiques avec un risque augmenté de prélèvements secondairement négatifs. Les autres privilégient le prélèvement synchrone exposant bien sûr la partenaire à un recueil négatif mais l’avantage est de se garantir des cas limites et d’avoir une idée objective sur la fécondance du sperme lorsqu’il est frais. En effet, en cas de non survenue de grossesse avec des spermatozoïdes congelés-décongelés se pose toujours à terme la question pour l’équipe ou pour le couple du retentissement de la congélation sur le pouvoir fécondant de ces spermatozoïdes. Ainsi donc la décision synchrone ou asynchrone ne pourra être le fruit que de la confrontation des souhaits du couple mais aussi de l’expérience de l’équipe (11).

Enfin, le cas bien particulier de ce que certains appellent les FIV semisynchrones c’est-à-dire la mise en attente en vue d’un éventuel prélèvement chirurgical du patient lors d’un cycle de prélèvement ovocytaire du résultat soit de la décongélation d’éventuelles pailles préalablement congelées soit d’une tentative d’extraction de spermatozoïdes sur un sperme limite. Là encore, la décision sera prise d’un commun accord entre le couple et l’équipe multidisciplinaire en connaissant le caractère très lourd du point de vue psychologique de ces approches.

Aujourd’hui donc, une stratégie semble se dégager au vu des expériences des différentes équipe. Soit il s’agit a priori d’une azoospermie excrétoire (c’est-à-dire à FSH normale, volume testiculaire normal), l’équipe maîtrise la congélation de sperme chirurgicalement et toutes les attitudes de prise en charge peuvent être proposées. Soit le diagnostic d’azoospermie sécrétoire est évoqué (FSH élevée, hypogonadisme, marqueurs séminaux normaux), le risque d’un éventuel prélèvement chirurgical négatif doit être évoqué et la décision du type de prélèvement, du mode d’organisation doit être discutée en multidisciplinaire mais aussi de façon très étroite avec le couple, en particulier s’il n’y a pas une maîtrise de la congélation des spermatozoïdes testiculaires. L’objectif à terme de cette stratégie est de permettre aux couples de réaliser leur plus cher désir d’un nombre minimal de cycle chez la femme, de prélèvement chez l’homme et surtout au prix de la moindre souffrance psychologique possible du couple.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1 – TARLATZIS B.C. et al Survey on intracytoplasmic sperme injection : report form the ESHRE ICSI Task Force Human Reprod., vol. 13, suppl. 1, p 165-177, 1998

2 – MANSOUR R.T. et al Intracytoplasmic sperm injection in obstructive and non-obstructive azoospermia Human Reprod., vol. 12, n°9, p.1974-1979, 1997

3 – TOURNAYE H et al Are there any predictive factors for successful testicular sperme recovery in azoospermic patients ? Human Reprod., vol 12, n°1, p 80-86, 1997

4 – LI-MING SU et al Testiculare sperme extraction with intracytoplasmic sperm injection for nonobstructive azoospermia : testicular histology can predict success of sperm retrieval J. of Urol., vol. 161, 112-118, 1999

5- JEZEK D et al Successful testicular sperm extraction (TESE) in spite of high serum follicle stimulating hormone and azoospermia : correlation between testicular morphology, TESE results, semen analysis and serum hormone values in 103 infertile men Human Reprod., vol. 13, n°5, p.1230-1234, 1998

6 – GORGY A et al The efficacy of local anaesthesia for percutaneous epididymal sperm aspiration and testicular sperm aspiration. Human Reprod., vol. 13, n°3, p 646-650, 1998

7 – SILBER S.J. The use of epididymal sperm for the treatment of male infertility Baillere’s Clin. Obst. and Gyn., vol. 11, n°4, p 739, décembre 1997

8 – ROSENLUND B. et al A comparison between open and percutaneous needle biopsies in men with azoospermia. Human Reprod., vol. 13, n°5, p 1266-1271, 1998

9 – SCHLEGEL P.N et al Physiological consequences of testicular sperm extraction. Human Reprod., vol. 12, n°8, p 1688-1692, 1997

10 – DONOVAN J.F.et al Comparison of microscopic epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection/in vitro fertilizatin with repeat microscopic reconstruction following vasectomy : is second attempt vas reversal worth the effort ? Hum. Reprod, 1998 feb, 13 (2), p 387-393

11 – PRINS G.S et al Quality of cyropreserved testicular sperm in patients with obstructive and nonobstructive azoospermia. J. of Urol., vol 161, p 1504-1508, 1999

Faut-il promouvoir la myomectomie chez les femmes désireuses de grossesse ? E. Daraï, A. Fortin, P. Madelenat

LETTRE A LA REDACTION : Transfert de blastocystes - incidence accrue de grossesses gémellaires monozygotes ?

Jean-Clément SAGE, Jacques CHOUTEAU
Centre de FIV Belledonne 23, Bd Maréchal Leclerc 38000 GRENOBLE

Il nous semble intéressant de rapporter ici une conséquence – à priori inattendue- des transferts embryonnaires au stade blastocyste : l’augmentation des grossesses gémellaires monozygotes observée depuis que nous réalisons nos transferts embryonnaires au stade blastocyste.

Le transfert des embryons au stade blastocyste s’accompagne d’une augmentation des taux d’implantation et des taux de grossesse. Cette amélioration est probablement liée à une meilleure sélection des embryons à bon potentiel évolutif, et peut être à une meilleure synchronisation avec la fenêtre d’implantation de l’endomètre. Initialement conduites sur des lignées cellulaires, en co-culture, ces cultures prolongées se sont peu à peu développées sur des milieux séquentiels. Du fait des meilleurs taux d’implantation, l’un des intérêts de cette technique est de ne plus transférer que un ou deux embryons, permettant ainsi de restreindre au maximum le risque de grossesses triples et de réduire encore le risque de grossesses gémellaires.

Aussi, cette augmentation des grossesses gémellaires monozygotes, si elle est confirmée, pourrait-elle limiter l’intérêt de ces transferts.

Depuis le début de notre activité FIV en 1985, nous n’avions observé que très exceptionnellement des grossesses gémellaires monozygotes.

Depuis 1996, nous avons mis en place cette technique de culture prolongée sur des milieux séquentiels et, entre 1996 et 1999, nous avons observé 11 cas de grossesses gémellaires, monozygotes, 3 grossesses gémellaires isolées après transfert d’un seul blastocyste et 8 grossesses triples après transfert de deux blastocystes.

Ce type d’observation ne semble pas avoir été rapporté précédemment avec les blastocystes obtenus par co-culture mais GARDNER a rapporté en 1998 dans Human Reproduction une série de plusieurs cas et quelques observations identiques ont été également rapportées récemment aux réunions de l’ESHRE à Göteborg et à Tours. Pour ce qui nous concerne, nous avons travaillé exclusivement sur des milieux séquentiels et l’une des hypothèses avancées attribue ce phénomène aux facteurs de croissance contenus dans ces milieux de culture. Une autre hypothèse implique les micro-manipulations susceptibles d’altérer soit le trophectoderme, induisant ainsi un hatching prématuré de la masse cellulaire interne, soit la MCI elle même qui pourrait alors se cliver plus facilement (mais dans ce cas de telles grossesses gémellaires monozygotes auraient dû être déjà observées avec les co-cultures).

Quelque soit le mécanisme en cause, ces grossesses, en particulier les gémellaires monozygotes associées à une grossesse unique, posent le délicat problème de leur gestion obstétricale : si une réduction embryonnaire paraît souhaitable sur le plan obstétrical, faut-il réduire la grossesse unique et laisser évoluer la grossesse gémellaire monozygote, connaissant la fréquence élevée des complications de telles grossesses , ou faut-il réduire l’un des embryons de la grossesse gémellaire en sachant que l’embryon restant risque de s’arrêter également du fait des anastomoses vasculaires, ou faut-il réduire d’emblée la grossesse gémellaire  et ne laisser que l’œuf unique ?

Aujourd’hui, ces observations préliminaires semblent devoir être plutôt attribuées aux techniques de culture qu’au simple hasard et il serait intéressant de rassembler d’autres observations identiques dans les équipes, encore peu nombreuses, qui pratiquent les transferts au stade blastocyste. JANSEN (Pays-Bas) a déjà crée un site internet concernant tout ce qui touche aux blastocystes, mais une étude spécifique française pourrait s’initier dans le cadre de la SMR et ce travail représenterait un projet attractif, permettant ainsi d’exploiter notre propre site internet SMR.

Cette idée n’est peut être plus tout à fait d’actualité à l’heure où la qualité des milieux séquentiels semble remise en question, et que beaucoup d’équipes ont du surseoir temporairement aux cultures prolongées. Néanmoins, si la technique de culture jusqu’au stade blastocyste reste potentiellement intéressante, ce risque éventuel accru de grossesses gémellaires monozygotes, associé aux difficultés et aux contraintes des cultures prolongées, conduit à reposer la question :

faut-il encore faire des transferts au stade blastocyste ?

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